2.4.3 免疫共沉淀 18

2.4.4 融合蛋白的真核表达 18

2.4.5 Western blot实验 19

2.4.6 免疫荧光实验 19

3 实验结果与分析 20

3.1 Ezrin蛋白的表达与分离纯化 20

3.2 Ezrin蛋白的磷酸化调节 20

3.2.1 Ezrin磷酸化对乙酰化修饰的影响 20

3.2.2 免疫共沉淀（CO-IP） 21

3.3 Ezrin蛋白在细胞中的定位 22

3.3.1 Ezrin在肾细胞来源的LLC-PK1中的定位 22

3.3.2 Ezrin在胃壁细胞内定位（原代细胞） 23

结 论 24

参 考 文 献 25

致谢 28

1 Ezrin蛋白

ERM蛋白家族由Ezrin、Radixin、Moesin这三种具有相近结构的蛋白组成，它们之间有75%～80%的同源性。它们在调节细胞骨架与细胞质膜的相互作用中具有重要的作用，同时，它们还是极化细胞中组成信号传导通路的重要成分，在细胞形态与运动的维持、调节信号转导及连接粘附分子等方面具有重要功能。Ezrin是极化表皮细胞的一个顶膜标记蛋白，它最初是作为蛋白质酪氨酸激酶受体的底物分离出来。据研究表明，很多肿瘤转移均与Ezrin在肿瘤细胞中的非正常表达有关[1]。论文网

1.1 Ezrin蛋白的生物学特性

1.1.1 Ezrin蛋白的分布

    Ezrin蛋白主要分布在微绒毛，细胞膜，纤毛和细胞间的连接处，同时它还与肌动蛋白的结合有关。

1.1.2 Ezrin蛋白的结构

    Ezrin蛋白最先由Bretscher 在鸡的小肠上皮细胞刷状缘中分离纯化出来，进一步研究表明，Ezrin 位于染色体 6q25.2- q26，相对分子质量为 81kDa，长度为1761 bp，编码587个氨基酸[1]。Ezrin 蛋白是由3个结构域组成[2,3]：一是FERM结构域，Ezrin蛋白分子内的N-末端和C-末端结构域之间的相互作用掩饰了蛋白之间相互作用的位点，并且维持该蛋白质在细胞质中的非激活状态[4]，同时Ezrin可与磷脂PIP2结合，并在C末端的苏氨酸残基域发生磷酸化[5]。当Ezrin在N-末端域被激活，FERM（Four-point-one, Ezrin,Radixin, Moesin）结构域可以与跨膜蛋白的细胞质部分结合，如CD44、ICAM、细胞质膜支架蛋白[6]和EBP50 [7,8]；二是α螺旋区，Ezrin的中心区域包含α螺旋结构；三是极性的肌动蛋白结合区，含有苏氨酸的磷酸化位点。这是Ezrin蛋白C端含有的一个丝状肌动蛋白/FREM结合域，它对与PKA的联系、F-actin的调控以及分子内互作具有非常重要的作用[9]。

    研究表明，在区分上皮细胞的组织、胞质分裂中对细胞皮层的固定、上皮的完整性和上皮管的管腔形态等各种单元中，Ezrin均具有非常重要的作用[10]。

1.1.3 Ezrin蛋白的表达

Ezrin 在大部分组织中均有表达，但是在不同的组织中还是存在不同的表达水平。其中在小肠、肺、胃、胰腺和肾中具有较高的表达水平，在脾、淋巴结、骨髓、胸腺种的表达水平次之，而在心脏、脑和肌肉中则表现较低的表达水平[11]。

Ezrin 在细胞中一般存在休眠和激活两种状态，当氨基端和羧基端相互作用导致蛋白结构发生折叠，其他分子的结合位点被C端的肽链所遮盖，此时，Ezrin处于失活的休眠状态；氨基端和羧基端分离使蛋白展开并和细胞膜及细胞骨架蛋白相互作用时，则是处于激活状态，[11]。