2。2。1  目的基因（cel1a）和启动子（Pact）的扩增

1、里氏木霉的培养 

本实验将在PDA培养基上培养里氏木霉，培养2天后，收集里氏木霉菌丝放于冷冻箱中备用。

2、里氏木霉基因组DNA的提取

取之前冷冻过的菌丝，加入液氮研磨成粉末状，转移至离心管中，加入2ml的CTAB提取缓冲液，65℃保温1h，间或轻摇混匀。1h后以8000 r/min的转速离心10 min。然后小心吸取离心管中上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇溶液，抽提10min（涡旋混匀，放置10min），然后以12000 r/min的转速离心10 min。取80%的上层液体（尽量多取）加入等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀，30min后以10000rpm的转速离心10min，之后取沉淀，加入500µL TE溶解，再加50µL NaAc。加入氯仿-异丙醇（1:1）后，静置10min，然后以12000rpm的转速离心，取上清（重复至中间层几乎没有）。加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30min，以10000rpm的转速离心10min。取离心后沉淀，用70%乙醇洗2次，加入300µL TE（已加入RNase）溶解。然后把溶液放置在4℃冰箱中备用。

3、cel1a的扩增

（1） 引物设计

根据cel1a克隆的DNA片段序列，设计引物为cel1a-Act-F和cel1a-R，cel1a-Act-F的序列为ATTAATCAGTCACAATGCTGCCCAAGGACTTTCAGTGG，其中波浪线标记序列是是Pact的基因序列，下划直线标记基因是cel1a的基因序列。cel1a-R的基因序列为ATTATATATAAGCTTGCCATCATGGTGCTGCTGTTTCTG，其中波浪线标记基因是HindⅢ限制性内切酶的识别位点，引物cel1a-Act-F和cel1a-R均为赛百盛基因技术有限公司合成。文献综述

（2） DNA聚合酶为Fastpfu酶的扩增

Fastpfu酶保真性较高，虽然 Taq酶价格便宜、易出结果，但是Taq酶不具有3'→5'的外切酶活性，在扩增过程中容易导致碱基的错配，从而引起基因突变，最后会影响基因的功能。可用于进行PCR摸索条件的实验，条件确定之后再改为Fastpfu酶，既保证扩增效率，又提高了保真性，可以合成较少的特异性弱的产物；正确率较高。PCR体系（25µL）为： 19。6 µL的H2O，2。5µL 10×（Fastpfu）buffer，1µL的基因组DNA，0。5µL的cel1a-Act-F，0。5µL的cel1a-R和0。4 µL的Fastpfu酶。PCR反应程序为：先预变性，94℃时间4 min后。94℃，30s变性，52℃ ，36s退火，70℃ ，2min延伸，三步为一个循环，进行30个循环后，72℃延伸5 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。具体电泳方法为：搭好制胶板，选择所需的孔大小的梳子，称取1g琼脂糖粉末，加入100ml 1× TAE，放入微波炉中加热溶解至透明无颗粒。稍冷却后倒入搭好的制胶板中，冷却凝固待用，切下所需孔数的凝胶，放入电泳槽中，孔在负极（黑色）端点样待样品中蓝色走到胶的2/3处时，停止电泳。取出凝胶，放入含EB的buffer中染色2min后，在紫外灯下观察跑胶结果。PCR体系多做几组，以备回收目的基因DNA所用。

（3） 琼脂糖凝胶回收cel1a的DNA（exDNA导纳凝胶回收试剂盒）

从凝胶中切下要回收的目的DNA条带，将大小在2。1kb左右的条带切下，置于1。5ml离心管中，称重加入3倍体积的Buffer DS，凝胶体积按1mg=1ml算。在上述试管中加入3µL exDNA Milk（使用时摇匀）。然后将试管摇匀，置于55℃至凝胶溶解（注：如果胶溶解后变紫色，说明pH偏碱性，可加入少量3M醋酸钠（pH5。2），使溶解液变偏黄色，可提高回收效果）。将上述试管取出摇匀片刻，于最高速离心40s即可，去上清液，再取200µL Buffer DS将乳白色沉淀溶解，可在Vortex震荡，重复离心步骤得乳白色沉淀。取500µL已含乙醇的Washing Buffer加入试管来洗涤沉淀。Vortex震荡，溶解后即离心40s。将所得沉淀再次洗涤，将上清液吸净，放在通风橱中，加速控干过程。沉淀控干后加入20µL双蒸水或TE缓冲液，震荡溶解沉淀即可，离心，上清液即含回收DNA。