CaMV35s启动子是目前创造转基因农产品过程中使用最为广泛的启动子[16]。本研究采用CTAB法抽提冬小麦基因组总DNA，通过核酸测定仪检测抽提的总DNA的浓度和纯度，将达到实验要求的基因组DNA作为模板，进行普通PCR检测，通过电泳图谱初步判断待测样品是否为转基因材料，但是由于在实验操作过程中，由操作或环境因素导致的假阳性或假阴性现象不可避免，为了进一步验证我们的待测样品，本研究进一步采用荧光实时定量 PCR对检测结果进行分析，并最终判断待测样品是否为转基因小麦。

2 材料与方法

2。1 材料

阳性质粒DNA (含有CaMV35s启动子基因）和待测样品由中国农业科学院国家检测中心提供，阴性常规冬小麦由淮阴师范学院刘乃森老师提供。

2。2 试剂与耗材文献综述

定性PCR所用Taq酶、dNTP、MgCl2、定量PCR所用2×GoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2。3 仪器设备 

 普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2。4 方法

2。4。1 DNA的提取与纯化 

本研究使用改进的CTAB法对小麦基因组总DNA进行抽提，实验步骤如下：

（1）将小麦颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取0。 2 g粉末装入 2mL离心管中。

（2）立即加入600μl已经预热到65℃的2×CTAB，混合均匀。

（3）将离心管转入65℃水浴，温浴40min，温浴过程中颠倒混匀数次。

（4）加入等体积（600μl）的氯仿:异丙醇（24:1）。

（5）颠倒混匀30分钟，室温4000rpm离心20分钟。

（6）取上清（约500μl）于新的1。5ml离心管中，加入等体积（500μl）的酚:氯仿:异丙醇（25:24:1）。

（7）颠倒混匀约5分钟，常温下4000rpm离心20分钟。

（8）取上清（约400μl）于新的1。5ml离心管中，加入200μl含有RNA酶的1M NaCl溶液。

（9）加入2/3体积（400μl）已预冷的异丙醇，混匀，—20℃放置30分钟，或更长或过夜沉淀DNA。

（10）4000rpm离心10分钟，弃去上清，倒扣在吸水纸上，静置1分钟，吸干水份。

（11）加入500μl75％的乙醇清洗DNA，洗涤至少20分钟，4000rpm离心10分钟，弃上清。

（12）重复步骤11，弃上清后置于超净台吹干。

（13）用100μl的超纯水溶解DNA，—20℃储存备用。

2。4。2引物和探针序列

本研究使用的引物和探针均根据农业部发布的检测标准进行，根据发布标准，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物和探针序列详见下表。

2。4。3 PCR检测 

（1）定性PCR扩增

 PCR技术是一种体外扩增技术，在引物、模板DNA和胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤核苷酸存在的条件下，进行的聚合酶的酶促反应，通过酶促反应，使DNA片段在数量上呈指数增加的技术，使用该技术能在短时间内获得大量的特定基因片段。 本研究根据实验室的一贯实验习惯，采用25ul反应体系进行PCR扩增，具体反应体系如下表。

    按照上述反应体系，分别设置阳性和阴性对照。以含有目标基因的质粒作阳性对照，以常规小麦基因组DNA作为阴性对照，反应体系配制完成后置于ABI公司生产的GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行PCR扩增，根据引物退火温度及扩增片段的大小设定扩增反应条件，详见表4。来~自,优^尔-论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-