1。2。3 钢珠法小量粗提基因组DNA3

1。2。4 CTAB法大抽提轮枝镰孢菌DNA4

1。2。5 DNA电泳方法4

1。2。6 大肠杆菌的转化4

1。2。7 质粒的提取方法4

1。2。8 质粒酶切5

1。2。9 敲除载体的构建5

1。2。10 PEG介导的轮枝镰孢菌原生质转化6

1。2。10。1 分生孢子制备6

1。2。10。2 幼殖体制备6

1。2。10。3 原生质体制备6

1。2。10。4 原生质体转化6

1。2。11 菌株ΔFvSwi6代谢产物研究技术路线7

1。2。12ΔFvSwi6代谢产物的分离纯化7

1。2。 13 化合物的结构鉴定9

1。2。 14 化合物的抗菌活性测定10

1。2。14。 1 菌丝生长抑制法10

1。2。14。 2 化合物有效抑制中浓度（EC50）的测定10

2 结果与分析11

2。1 基因FvSwi4和FvSwi6的敲除11

2。2 敲除基因的突变体菌株在培养基中的生长12

2。3 轮枝镰孢菌对玉米穗及玉米茎干致病性测定12

2。4 基因敲除后突变体菌株ΔFvSwi6和ΔFvSwi4代谢产物中色素组成13

2。5 ΔFvSwi6中两种色素化合物的分离结果13

2。6 化合物的结构鉴定（从菌株ΔFvSwi6中分离获得）14

3 讨论 14

致谢15

参考文献15

轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)中 Swi4-Swi6复合体生物学功能研究

引言 Swi4和Swi6是两个重要的bHLH类转录因子，在真核生物的生长发育过程中具有重要作用。在禾谷镰刀菌(Fg,Fusarium graminearum)中，对该基因的研究发现，FgSwi6会影响菌丝生长，子囊壳的形成，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON, Deoxynivalenol)的合成。在稻瘟病原菌中，发现MoSwi6的突变体会导致稻瘟病原菌致病性下降，会干扰表面活性氧的产生，影响真菌色素的合成。本研究通过生物性息学预测，在轮枝镰孢菌Fv(Fusarium verticillioides)克隆并敲除了与酵母Swi4和Swi6同源的两个基因（分别命名为FvSwi4和FvSwi6）对他们的生物学功能进行了研究。研究发现，敲除这两个基因的突变体导致菌落的颜色发生改变（见图2。1），分离提纯菌株的次生代谢产物，发现野生型菌Fv102、突变体FvSwi4和FvSwi6（以下称为ΔFvSwi4和ΔFvSwi6）的色素表达均有不同（见图2。2）：Fv102和ΔFvSwi6都能产生一种蓝绿色色素，而ΔFvSwi4表达却不明显；ΔFvSwi4和ΔFvSwi6都能产生一种黄色色素，而Fv102却不表达；此外，ΔFvSwi4能产生Fv102和ΔFvSwi6表达均不明显的红色色素。因此实验决定进一步对菌株进行放大培养，对目标菌株发酵产物应用溶媒萃取、硅胶层析、凝胶Sephadex LH-20、HPLC等手段，分离提纯出目标色素，鉴定出化合物的结构，并进一步测定化合物的抗菌活性。

1 材料与方法

1。1 材料

1。1。1 菌株

轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）7600；大肠杆菌感受态Top10；

1。1。2 抗菌实验指示菌株

小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum） 油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）

马铃薯干腐病菌（Fusarium sulphureum）辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）

水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani） 小麦纹枯病菌（Rhizotonia cerealis）

水稻恶苗病菌（Fusarium moniliforme）番茄早疫病菌（Alternaria solani）

1。1。3 质粒

南京农业大学生防与细菌分子生物学实验室保存的FvSwi4和FvSwi6潮霉素抗性敲除载体

1。1。4 主要仪器

PCR仪 日本 TaKaRa

 电泳仪 北京六一仪器厂

Agilent 1200液相色谱仪美国 Agilent

EYELA N-1100旋转蒸发器日本 EYELA