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1。1。5 主要试剂及耗材

一次性使用培养皿江苏康健医疗用品有限公司 

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点样毛细管（0。5mm*100mm） 华西医科大学仪器厂

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1。1。6 常用培养基论文网

MM液体培养基：0。5g氯化钾，2g硝酸钠，1g磷酸二氢钾，0。5g七水合硫酸镁，0。01g七水合硫酸亚铁，30g蔗糖，加水至1L，PH6。9，每1L再加200μl的1×Trace elements混合液。

MM固体培养基：MM液体培养基100ml，1。5g琼脂混匀115℃灭菌30min。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，PH 7。4。

PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1OOOmL;

1。2 方法

1。2。1轮枝镰孢菌的培养、保存、以及产胞方法

轮枝镰孢菌在培养箱25℃中生长在PDA或者CM平板上，3天后挑取一小块菌丝接种于斜面PDA上，生长3天后于4℃冰箱中保存。轮枝镰孢菌分生袍子的产生需要挑取少量菌丝块于CMC培养基中，在25 ℃的光照培养箱中180rpm培养3天以上后，三层擦镜纸过滤8000rpm，10min离心收集。

1。2。2轮枝镰孢菌对玉米茎干及玉米粒的致病性测定

1）接种CM平板上的Fv102菌饼到装有100ml CMC液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，180rpm光照培养72小时。用无菌三层擦镜纸过滤培养基，在室温下7000rpm离心20min，收集孢子。

2）用血球计数板，计数孢子浓度，用无菌水稀释孢子浓度至1x106。

3）选生长4周大的玉米，在离地面第3节的茎干上用无菌牙签戳破，之后向孔内注射20ul收集的孢子悬浮液。用纱布保湿处理2周后，拍照。

4）用无菌牙签蘸取孢子悬浮液，戳破玉米粒中央，之后喷水保湿8d后，拍照

1。2。3钢珠法小量粗提基因组DNA

1)在平板上挑取新鲜菌丝0。1g左右，置于2 ml离心管中；

2)在装有菌丝的离心管中加入600ul左右的DNA裂解液(DNA lysis buffer )，加研磨钢珠1到2颗；

3)将2 ml离心管加入样品研磨器中，以65HZ的频率震荡1 min左右；

4)研磨好的样品静置10 min后于4℃，冷冻离心机中13200 rpm离心10 min以上；

5)吸取上清液后到新的离心管中，加入无水乙醇750ul，缓慢得颠倒混匀；

6)12000 rpm，4℃离心5 min；

7)弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀，倒扣离心管，干燥后用50-100ul双蒸水溶解，溶解液即为轮枝镰孢菌基因组DNA。

1。2。4 CTAB法大抽提轮枝镰孢菌DNA

1)接种新鲜培养轮枝镰孢菌菌块接种于200 ml YEPD培养液中，在25℃摇床中，180 rpm培养36 h。

2)用纱布或者擦镜纸过滤菌丝，用灭菌水洗涤菌丝2-3次，用吸水纸吸干菌丝中的水分，加入液氮中研磨成细粉状。

3)加入65℃ 预热后的10 ml CTAB抽提液稍稍震荡，在65℃水浴锅中加热1h，并每20 min不时上下摇匀。

4)在4℃冷冻离心机中以9000 rpm离心超过10 min，取上清液于新管中。