5)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇((v:v:v=25:24:1)，振荡混匀(避免剧烈振荡)。

6) 9000 rpm，4℃离心10 min，取上清液于新管中。

7)加入等体积的氯仿/异戊醇(v:v=24:1),颠倒混匀。

8)将混合液12000 rpm，4℃离心10 min， 取上清液于新管中。

9)加入已在-20℃中预冷的无水乙醇(加入量为上清液2倍体积)，混匀，并在-20℃冰箱中静置1-2 h。

10)在4℃冷冻离心机中1000 rpm离心10 min，弃去上清。

11)使用10m1 70%乙醇洗涤5次，洗涤后在1000 rpm下离心5min，保留沉淀，并于空气中干燥。

12)干燥后加入400ul双蒸水溶解DNA，并于37℃培养箱中加入1ul的10mg/ml, ribonuclease solution (RNase)温育1h以上。

1。2。5 DNA电泳方法

1)1%琼脂糖凝胶的制备:称取适量琼脂糖粉末置于合适大小的三角瓶中，加入适量1xTAE缓冲液，于微波炉内反复沸腾，待冷却后注入已插上电泳梳的电泳版，待凝胶完全凝固后拔去梳子置于4度冰箱待用。

2)DNA样品的加入:首先将电泳板置于注入适量1xTAE缓冲液的电泳槽中，将DNA样品混合液(混有适量DNA上样缓冲液加入电泳板的点样孔，靠近负极的一侧为加样孔，加样完毕后以200V左右的电压电泳30 min左右。

3)DNA条带的成像:电泳结束后小心得将凝胶置于盛有适当浓度的EB溶液中，浸泡超过10 min后于Tanon 2500成像系统中在紫外光下观察DNA条带。

1。2。6 大肠杆菌的转化

1)于-70℃冰箱中取出大肠杆菌感受态并置于冰上5min解冻。

2)于解冻的大肠杆菌感受态100ul中，加入待10ul转化片段，缓慢摇匀后冰上放置30min。

3)将大肠杆菌感受态于42℃热激90s后,将其迅速将置于冰上2min。

4)向置于冰上的感受态中加入800ul LB液体培养基，于37℃摇床中150rpm培养1h左右。

5)将培养好的菌液12000rpm离心2min，用移液器移去400ul，保留的菌液摇匀并用涂布棒均匀涂布于含有抗生素的培养平板上，于37℃培养箱中培养12-24h。

6)挑取平板上的单克隆，用加有相应抗生素的LB液体液摇培养，待PCR鉴定阳性克隆。

1。2。7质粒的提取方法文献综述

Omega质粒提取试剂盒D6943-01购买于南京丁贝生物基因技术有限公司:

1)取2 ml左右过夜培养的含有相应质粒的菌液于2 ml离心管中，12000 rpm离心1min后弃去上清并将离心管倒扣与吸水纸上；

2)加入含有RNase A的Solution1 100ul,悬浮离心管中的细菌沉淀，用涡旋仪震荡混匀该悬浮液；

3)加入Solution2 250ul；后缓慢得上下颠倒混匀，使悬浊液形成透亮均一的溶液。

4)加入Solution3 350ul，缓慢得上下颠倒混匀产生白色沉淀后，12000rpm，离心10min

5)将离心管中的上清液加入质粒吸附柱中静置5 min后12000 rpm离心1 min；

6)弃滤液，加入HBC buffer 500ul，12000rpm，离心1min；

7)弃滤液，加入700ul Washing Buffer ,12000rpm,离心1min。

8)重复步骤7。

9)弃滤液，13200rpm，将空的管子离心3min。

10)将质粒吸附柱放入新的离心管中，室温晾干10 min后,在质粒吸附柱的膜中央加入65℃加热的50-60ul Elution Buffer，静置2 min后12000 rpm离心3 min，所得的液体于4℃或者-20℃保存。

1。2。8质粒酶切

1)酶切体系:

10xbuffer 1 ul

质粒 3 ul

Restriction enzyme 0。6 ul

加ddH20至 10 ul

2)用移液器吸打混匀；

3)于37℃金属浴中温育3-4h左右；

4)取3ul左右进行琼脂糖凝胶电泳观察质粒或者DNA的酶切情况；