5)酶切反应结束后于65℃，水浴5min终止反应；

注:当需要大量酶切质粒时可以采用50ul或者100ul体系。

1。2。9 敲除载体的构建

基因敲除通过同源重组双交换的方法。敲除载体通过片段融合PCR的方式得到同源臂与抗性片段融合后的大片段。轮枝镰孢菌的基因的上下游片段核苷酸序列通过网站http://fungi。ensembl。org/species。html中，获得，设计引物使用http://www。yeastgenome。org/网站。

同源臂扩增：（PrimeSTAR® HS DNA Polymerase）标准50ul体系：

5×PrimeSTAR® Buffer（Mg2+ plus） 5ul

dNTP Mixture 2ul

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 1ul

DNA template 1ul

Primer F 1ul

Primer R 1ul

加dd H20 to 50ul

PCR程序： 95℃ 5min

98℃ 10s

55℃ 15s

72℃ 1min

72℃ 10min

12℃ forever

重叠PCR体系：

5×PrimeSTAR® Buffer（Mg2+ plus） 5ul

dNTP Mixture 1ul

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 1ul

左臂 1ul

潮霉素片段 3ul

右臂 1ul

加dd H20 to 25ul

PCR程序： 95℃ 2min

98℃ 10s

58℃ 1min40s

72℃ 3min

72℃ 10min

12℃ forever

1。2。10 PEG介导的轮枝镰孢菌原生质转化

1。2。10。1分生孢子制备

接种CM平板上的Fv102菌饼到装有100ml CMC液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，180rpm光照培养72小时。用无菌三层擦镜纸过滤培养基，在室温下7000rpm离心20min，收集孢子。

1。2。10。2幼殖体制备

弃掉上清液，将孢子调至1x107，吸取1ml转移到含有100ml YEPD液体培养基的250ml三角瓶中，在摇床上25 ℃ ，180 rpm摇16小时。

1。2。10。3原生质体制备来~自,优^尔-论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

配制轮枝镰孢菌细胞壁裂解酶液，用Millipore 0。45um 无菌滤器过滤酶解液，三层擦镜纸过滤，收集幼植体。之后将过滤好的酶解液与幼植体混合（每1g幼植体加入20ml酶解液）充分摇匀，放入28℃摇床150 rpm裂解35h左右。待充分裂解后用无菌三层擦镜纸过滤混合物到无菌的50ml离心管中，并用0。7M NaCl冲洗尽可能多的将原生质体洗下来，所得滤液4 ℃,5000rpm离心10min，弃去上清，加入10ml 0。7MNaCl 轻微的重新悬浮，之后分装到2ml离心管中，4 ℃,5000rpm离心2min，弃去上清将，沉淀用600ul STC溶液缓慢得吸打混匀后于冰上待用。

1。2。10。4原生质体转化

向上述冰上STC所溶解的原生质液体中1ml STC buffer，250ul SPTC buffer，100ul敲除载体，10ul 肝素钠，轻轻吸打混匀。冰上，避光静置30min。再加入400ul SPTC buffer，吸打混匀，室温避光静置20min。将混合液加入盛有20 ml RM的三角瓶中，缓慢混匀，并置于暗处20 min，将三角瓶置于25℃，100 rpm避光过夜。第二天待原生质体恢复成细小的菌丝后加入到混有含有潮霉素或者g418的CM培养基中，倒平板，并25℃培养三天，挑取转化子并鉴定。