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2。2 实验方法

2。2。1 黄酒糟中醋酸菌的筛选及鉴定

2。2。1。1 分离、纯化和鉴定流程

黄酒糟→增殖培养→平板分离 →理化鉴定→ PCR技术鉴定→确定醋酸菌种类→液体培养→甘油保藏菌种 。

2。2。1。2 增殖培养

取5g黄酒糟，放人250 mL三角瓶中，瓶中已盛有95 mL醋酸菌液体培养基。在温度为30℃，200r/min摇床条件下培养3~5d，得到增殖培养液。

2。2。1。3 醋酸定性试验

取（2）增殖培养液10 mL，以2500r/min离心6 min，除去菌体。取5mL上清液，用0。1mol/LNaOH溶液中和上清液。然后将中和后的上清液，用酒精灯加热至沸腾，加入6~8滴的5％FeC13溶液，如果形成红褐色沉淀就可以确定有醋酸。论文网

2。2。1。4 分离纯化

从增殖培养液中取lmL，以10倍递增作稀释，稀释至10-1-10-8用无菌生理盐水。分别取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释液各0。1mL，把各个梯度分别涂布到醋酸菌固体培养基钙化平板上。在培养30℃下培养3~5d，观察菌落生长情况。挑选有钙溶解圈而且大的单个纯菌落进行纯化，在醋酸菌固体培养基钙化平板划平板，在温度为30℃培养条件下2~3d。革兰氏染色后，镜检。

2。2。1。5 菌种鉴定

（1）菌体形态的观察

    ①将显微镜取出，放在平稳的实验桌上，载物台不能倾斜。

    ②采用以自然光为光源，用平面反光镜。

 ③开启光圈，然后转动反光镜，使光源聚焦在集光器上，根据自己所需然后上下移动集光器和缩放光圈，从而得到最好的光度。

    ④将连接电子显微镜与电脑间的数据线安装完毕，打开电脑上程序驱动软件。

 ⑤在载玻片上用接种环沾取一环，用牙签挑取菌落，在一环水上涂抹均匀结晶紫染色1min，用水洗去浮色，再用文火将水分烧干。用革兰氏碘液媒染1min后洗干，再用脱色液脱色，最后用复染液复染10s，等到干。

    ⑥将载玻片放在载物台上，先采用低倍镜找出菌落的适宜位置。在需要观察的部位滴一滴香柏油，然后换油镜进行观察，保存细菌菌体图片。

（2）16S rDNA法鉴定菌种[17]

挑取纯化的单菌落。用两种合成的通用引物（27F和1492r）进行PCR法鉴定，PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒回收，经过纯化后送上海生工生物技术公司测序。测序结果在NCBI数据库中BLAST进行比对，对比对结果做进化树，以确定菌株的种属。