亚硝酸盐还原酶发酵工艺研究(6)
（3）发酵产酶培养基--MRS液体培养基
葡萄糖：20.0 g；牛肉膏：10.0 g；酵母膏：5.0 g；大豆蛋白胨：10.0 g；无水乙酸钠：5.0 g；柠檬酸三铵：2.0 g；磷酸氢二钾：2.0 g；硫酸镁：0.58 g；硫酸锰：0.25 g；吐温80：1 mL；去离子水：1000 mL，调节pH值6.4。121℃高压蒸汽灭菌20 min。
2.1.4 实验设备
本实验使用的设备见表2.4所示:
表2.4 实验设备
设备 厂家 型号
电子天平 上海精科实业有限公司 MP200B型
可见分光光度计 上海菁华科技仪器公司 721型
电热恒温水浴锅 上海恒科仪器有限公司 HWS12
台式离心机 上海湘仪离心机仪器有限公司 L-530型
真空干燥箱 上海一恒科技有限公司 DZF_6090型
低速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司 DM-46型
发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司 2002型
超净工作台 上海博迅有限公司医疗设备厂 SW-CJ-2FD型
生化培养箱 上海精宏设备有限公司 SHP-150型
2.2 实验方法
2.2.1 亚硝酸钠的测定：盐酸萘乙二胺法
（1）标准曲线的制作
本实验采用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸钠的含量，所需配制试剂如下：
饱和硼砂溶液：称取50.0 g硼酸钠，溶于1000 mL热水中，冷却备用。
乙酸锌溶液：称取220.0 g乙酸锌，加入30 mL冰乙酸溶于水，并稀释至1000 mL。
亚铁氰化钾溶液：称106.0 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000 mL。
盐酸萘乙二胺溶液：称取0.1 g盐酸萘乙二胺，溶解于50 mL水中，混匀后，置棕色瓶中，避光4℃冰箱内保存，最好现用现配。
对氨基苯磺酸溶液：称取0.4 g对氨基苯磺酸，溶于100 mL 20﹪盐酸中，置于棕色瓶中混匀，避光保存。
亚硝酸钠标准溶液：准确称取10g亚硝酸钠，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于20 μg的亚硝酸钠。
取1mL亚硝酸钠标准溶液，稀释至4mL，此溶液每毫升相当于5.0 μg亚硝酸钠，分别取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于50mL的容量瓶中，加入40 mL蒸馏水，摇匀后，分别加入2mL磺胺溶液，摇匀避光3min，分别加入1mL盐酸萘乙二胺，定容后摇匀，避光15min后，538波长下测OD值，汇总数据做亚硝酸钠标准曲线图。
标准曲线如图2.1 所示
图2.1 亚硝酸钠标准曲线
由图2.1可以看出，亚硝酸钠标准曲线的相关系数为0.999。
线性方程：
A=0.0228×C+0.0024 （3.1）
式中：A—OD538nm
C—亚硝酸钠溶液浓度(µg/50mL)
（2）样品测定
吸取5mL样品置于250mL三角瓶中→加饱和硼砂溶液12.5mL 摇匀→加50mL蒸馏水 沸水浴15min→取出冷却至室温→转入100mL容量瓶→加5mL亚铁氰化钾溶液 混匀→加5mL乙酸锌→定容至100mL 混匀 静置30min 沉淀样品中的蛋白质→取10mL上清液于离心管中 3000r/min离心5min→吸取2mL上清液于50mL容量瓶中→加水40mL 摇匀→滴加2mL对氨基苯磺酸 摇匀 避光3min→加1mL盐酸萘乙二胺 定容至50mL 混匀→避光15min →测538nm下的吸光度。
样品中亚硝酸盐含量:
C（µg/mL）=（A-0.0024）×8/0.0228 (3.2)
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