亚硝酸盐还原酶发酵工艺研究(8)
（2）硫酸铵+酵母膏
在5*200mL硫酸铵10g+酵母膏7g培养基中，接入接种量为5%乳酸菌，37℃恒温培养箱分别培养1h、2h、4h、6h、8h后取出，取样测定610nm下吸光度值，再分别加入200µg/mL NaNO2，分别取样，以蒸馏水为对照，测定538nm下吸光度，继续放入37℃恒温培养箱培养23h后取出，取样测定538nm下吸光度。
2.2.6 菌体海藻酸钠固定化降解亚硝酸钠
（1）5L发酵罐扩大培养
①菌体活化：将菌体接入种子培养基，37℃恒温培养培养24h。
②空消：空罐灭菌。
③实消：将3L发酵培养基从进样口倒入5L发酵罐中，盖上盖子。检查发酵罐安装完好后，校正pH电极、溶氧电极，121℃灭菌30分钟。
④接种与发酵：待发酵液冷却到37℃后，将活化后的菌体按3%的接种量接入发酵培养基，在接种圈的火焰保护下，将发酵培养液倒入发酵罐中，控制发酵温度37℃，pH为7.0，发酵罐搅拌：50r/min，18h停止通风和搅拌。以NaOH为中和剂。
⑤收集菌体：培养18h后下罐取样测定610nm下吸光度值，发酵结束后收集菌体。
（2）海藻酸钠固定化
取5mL菌悬液分别加入10mL、15mL、20mL海藻酸钠固定化，按2%接种量加入100mL200µg/mL NaNO2溶液中，确定最适包埋度。包埋具体方法如下：
称取适量的海藻酸钠→加入盛有适量无菌水的烧杯中→加热溶化→将溶化好的海藻酸钠冷却至40℃→加入活化好的菌种→充分搅拌混匀→将上述菌液吸入灭菌注射器中→以一定速度滴人CaCl2溶液中使其凝稠成珠状→凝珠在CaC12中浸泡4分钟后捞出→用无菌水冲洗→将制好的凝珠在无菌条件下风干→除去凝珠表面水分及部分内部水分→将风干好的凝胶珠用塑料袋或铝箔袋等材料密封包装常→低温保藏待用
（3）降解废水中亚硝酸钠
取3*100mL废水，其中一瓶加入50μg/mL NaNO2，另一瓶加入50μg/mL NaNO2和菌悬体，30℃恒温培养，以等量的蒸馏水代替样品，做空白对照，分别隔2h、4h、6h、18h、24h取样测定在538nm下测其吸光值。
3结果与分析
3.1 降解亚硝酸钠的研究
3.1.1 降解亚硝酸钠的测定
（1）培养基加入NaNO2
将菌株接种到200mLMRS培养基中，分别加入不同终浓度亚硝酸钠，37℃恒温培养18h取样，以等量的蒸馏水代替样品，做空白对照，在538nm下测其吸光值。以NaNO2浓度为横坐标，NaNO2降解量为纵坐标，绘制降解图。
亚硝酸钠降解量如下：
图3.1 亚硝酸钠降解量
由图3.1所示，菌体在MRS培养基37℃培养18h后，菌体内亚硝酸钠的降解量明显，且起伏较大，其中亚硝酸钠终浓度为200µg/mL时降解量最高，为24.77µg/mL，而终浓度为100µg/mL时，降解量最低，为10.04µg/mL。
（2）培养6h后加入NaNO2
将菌株接种到200mLMRS培养基中，37℃恒温培养6h后，分别加入不同终浓度亚硝酸钠，37℃恒温继续培养18h取样，以等量的蒸馏水代替样品，做空白对照，在538nm下测其吸光值。以NaNO2浓度为横坐标，NaNO2降解量为纵坐标，绘制降解图。
亚硝酸钠降解量如下：
图3.2 菌体培养6h后亚硝酸钠降解量
由图3.2所示，菌体在MRS培养基37℃培养6h后加入亚硝酸钠继续培养，菌体内亚硝酸钠的降解量与直接加入亚硝酸钠有所不同，降解量上升趋势，其中亚硝酸钠终浓度为250µg/mL时降解量最高，为33.89µg/mL，而终浓度为50µg/mL时，降解量最低，为12.49µg/mL。整体降解量高于直接加入亚硝酸钠的降解量，效果明显。
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