大肠杆菌表面展示体系磷酸盐吸附能力的初步研究(4)
1.4.5大肠杆菌磷酸盐吸附蛋白
1.4.5.1大肠杆菌磷运输系统
磷是细菌细胞生长和代谢不可或缺的重要元素。磷元素的获得主要通过从环境中摄取磷酸盐等含磷物质，运输进入细胞内部达到为细菌细胞自身利用的目的。这一过程中涉及到磷酸盐的吸收运输调控机制以及表达的一系列相关蛋白。磷被大肠杆菌吸收以及在大肠杆菌细胞内的运输主要通过两个系统即“PST系统”(Phosphate．specific transport system)和“PIT系统”(Phosphate inorganic transportsystem)完成。PST系统是由一组典型的细胞周质蛋白质组成。一共4个基因编码的蛋白质参与了该系统的磷酸盐运输过程，它们是phoS、pstA、pstC和pstB。phoS基因编码的磷酸盐结合蛋白是PST系统磷酸盐吸收运输的关键蛋白，在细胞周质空间中结合磷酸盐并转运至细胞质膜。PST系统的转膜部分由pstA和pstC两基因编码的包括6个跨膜a．螺旋结构域构成的疏水蛋白质组成。pstB基因编码的亲水性蛋白质包含ATP结合结构域，该蛋白与PstA和或PstC蛋白在细胞内膜的胞质一侧结合。突变实验表明，在PstB提供的ATP能量作用下，PstA和PstC的a．螺旋结构域控制磷酸盐通道的开启和闭合，磷酸盐通过PstA和PstC中间的3个精氨酸/谷氨酸(或天冬氨酸)盐桥被转移至胞质。PST系统的调控通过phoU基因编码的调控蛋白完成(基因phoS、pstA、pstC、pstB和phoU共同组成的操纵子与其它一些磷饥饿诱导基因组成pho(phosphate)调节子。当磷酸盐充足时，phoS基因的表达处于低水平状态。在环境中磷酸盐有限时，phoR基因表达的整合膜蛋白传感器通过磷酸化作用将phoB蛋白转化成具有活性的形式，phoB蛋白在转录水平上激活pho调节子中各个基因的表达。PST系统在磷酸盐浓度高于lmM时受到抑制，但能抵抗解偶联抑制剂。在PIT系统中，基因pit是主要基因。该系统允许细胞内外磷酸盐的交换，无需磷酸盐结合蛋白，受到解偶联抑制剂的抑制。研究表明，两种系统的磷吸附最大速率基本相同，但PST系统对磷的特异性和亲和能力明显高于PIT系统。
1.4.5.2磷酸盐吸附蛋白(PBP)
磷酸盐吸附蛋白(PBP)是细胞周质蛋白，是参与大肠杆菌PST系统磷酸盐吸附运输的蛋白质之一。PBP的编码基因为phoS，是负调控基因，有自己的启动子，在细菌细胞磷饥饿状态下诱导表达。phoS编码的氨基酸序列是PBP前体，N末端含有25个氨基酸残基的信号肽序列，通过ABC(ATP．binding cassette)转运系统帮助PBP蛋白转运至细胞周质。成熟的PBP蛋白包含321个氨基酸残基，分子量大小约为34 kDa，缺乏半胱氨酸和甲硫氨酸[23]。对PBP蛋白结构分析表明，在80位缬氨酸处有一极为疏水的结构，这一疏水核心不含二硫键，对PBP蛋白的活性构象起稳定作用。PBP蛋白含有的四个精氨酸残基在与底物磷接触及结合作用中起重要作用[24]。三文结构分析表明，PBP蛋白可分为两大结构域，这两个结构域铰合在一起，中间形成疏水缺口，当磷酸盐结合到缺口处时，两结构域紧密围绕磷酸盐将其包裹其中，便于跨膜运输至细胞周质[25]。尽管有报道显示大肠杆菌在富含磷的培养基中培养后能检测到PBP表达，但当细菌所处环境中磷含量有限时，在础DB基因的调控下，该蛋白在细胞周质中快速大量表达。PBP的缺失会使PST系统丧失对底物磷酸盐的亲和能力[26]。将phoS基因单独克隆至质粒上过量表达时，大量的PBP蛋白前体在内膜和胞质中累积，不仅降低成熟PBP的产生效率，而且阻碍了其它细胞周质蛋白的产生效率。
1.4.5.3磷酸盐吸附蛋白的应用
磷酸盐吸附蛋白可作为生物传感器检测磷酸盐。通过突变的方法将标记有荧光基团的半胱氨酸引入PBP蛋白磷酸盐结合位点的边缘，当PBP与磷酸盐结合后，缺口关闭，此时荧光基团所产生的荧光强度提高13倍，当PBP释放后，荧光强度迅速降低([27]。利用该原理，荧光标记的PBP被用来检测各种ATPase和GTPase快速释放的磷酸盐，检测敏感度精确到微摩尔水平甚至更低[28]。也有报道将罗丹明标记的半胱氨酸分别引入两个结构域的磷酸盐结合位点边缘，单独的罗丹明染料能够发出强荧光，当PBP蛋白结合磷酸盐后，缺口封闭，两罗丹明以非共价键的方式形成二聚体，荧光消失。这一改进可以用于单分子的研究，高通量筛选的研究和细胞内磷酸盐的迁移研究等，进一步拓宽了荧光标记的PBP作为生物传感器的应用范围。PBP蛋白还可用于吸附水中的磷酸盐，达到净化的目的。Kuroda[29]等将铜绿假单胞菌的PBP蛋白纯化后固定于具N．羟基琥珀酰亚胺活性的琼脂糖凝胶上，置于层析柱中，含磷酸盐的水通过层析柱，磷酸盐因被PBP蛋白吸附而从水中去除。然而，这种方法成本高费时费力，显然不利于实际应用。
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