大肠杆菌表面展示体系磷酸盐吸附能力的初步研究(6)
注：等JM109单菌落加入PCR小管后再加Taq酶
扩大：PCR反应体系扩大到50μL做2管（1管对照）
图2-3 50μL PCR反应体系
试剂名 反应组 对照组
10×PCR buffer 5.0μL 5.0μL
phoS1 2.0μL 2.0μL
phoS2 2.0μL 2.0μL
Mg2+ 3.0μL 3.0μL
dNTP 2.0μL 2.0μL
Taq 1.0μL 1.0μL
去离子水 35μL 35μL
JM109单菌落 加 不加
注：等JM109单菌落加入PCR小管后再加Taq酶
PCR之后取5μL电泳（DL2000 Marker）。
2.4磷酸盐吸附试验
2.4.1 标准曲线的制作
1）准确吸取0，0.5，1，2，3，4 mL磷酸盐标准溶液(1 mL含0.1 mg PO43-)，分别加入到6支50 mL比色管中，用去离子水稀释至10 mL；
2）向各比色管中准确加入4 mL钼酸钠-硫酸溶液及1 mL 0.15%硫酸肼溶液（w/v），混匀，放入沸水浴中煮沸10 min，取出，立即流水冷却，用去离子水稀释至刻度，混匀；
3）以试剂空白为对照，在波长660 nm处进行分光光度测定。以吸光度为纵坐标，磷酸盐(以PO43-计)含量(毫克)为横坐标绘制标准曲线。
2.4.2 磷酸盐浓度的测定
1）将1 mL上清液，30 mg亚硫酸钠，4 mL钼酸钠-硫酸溶液和5 mL去离子水加入比色管，沸水浴中煮沸10 min，取出；
2）向管中加入1 mL 0.15%硫酸肼溶液，混匀后继续煮沸10 min，取出，用流水冷却并用去离子水稀释至刻度，混匀；
3）以试剂空白为对照，在波长660 nm处测定其吸光度，从标准曲线上查得相应的总无机磷酸盐（以PO43-计）含量（毫克）。
2.4.3活菌磷酸盐吸附能力实验
1）大肠杆菌待测菌株在50 mL无机磷培养基中，37 ºC震荡培养至对数生长中期（OD600=0.6~0.8），用0.1 mmol/L IPTG于20 ºC诱导24 h；假单胞菌待测菌株在50 mL无机磷培养基中，28 ºC震荡培养12 h；
2）以8000 r/min，2 min离心收集菌体，灭菌去离子水洗涤菌体，用含0.5 mg/mL PO43-的磷酸二氢钾溶液调整菌液至OD600为1.0，置于室温摇床上，每隔1 h取1 mL样品，以8000 r/min，2 min离心，取上清；
3）按照2.4.2的方法测定磷酸盐浓度。
2.4.4热致死菌磷酸盐吸附能力试验
将50 mL培养好的待测菌液以8000 r/min离心2 min，收集菌体，去离子水洗涤1次并于42 ºC烘干过夜。取一部分菌体用灭菌去离子水重悬，涂布LB平板，在相应温度下培养24 h，以确认菌体是否死亡，余下菌体用含0.5 mg/mL PO43-的磷酸二氢钾溶液调整至OD600为1.0，置于室温摇床上，5 h后取1 mL菌液以上述磷酸盐吸附能力测定方法测定上清中磷酸盐含量（详见2.4.2）。
2.5生长曲线的测定
以受体菌JM109为对照，将重组菌接种于无机磷培养基于37℃培养，每隔4h取一次样测定OD600值。绘制生长曲线，确定重组质粒的导入是否对大肠杆菌的生长产生影响。
3结果分析
3.1 pMB109质粒的提取
将用质粒小量抽取试剂盒提取的质粒上样于0.8%琼脂糖凝胶，电泳结果见图3-1，由图可知质粒提取成功。
图3-1 提取质粒电泳图
泳道1，2：标记为MB109的菌种中提取的质粒pMB109
3.2 PCR扩增phos基因
以提取的质粒为模板，用能扩增phoS基因的引物对phoS1和phoS2进行PCR扩增，反应结束后，将PCR产物上样于0.8%琼脂糖凝胶，电泳结果见图3-2，由图可知PCR产物大小与phoS基因大小相符，表明进行磷酸盐吸附实验的重组菌正确。
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