大肠杆菌表面展示体系磷酸盐吸附能力的初步研究(5)
1.5本课题的研究目的和意义
随着微生物细胞表面工程近年来的发展，利用细胞表面展示技术可将外源蛋白展示于细胞表面，使外源蛋白充分与环境中底物分子接触，生产一些供人类生活实践应用的生物产品。本课题以展示磷酸盐吸附蛋白的大肠杆菌重组菌为研究对象，优化其培养和测定条件，测定其磷酸盐吸附能力，为进一步研究展示体系的展示效率和应用领域奠定基础。本课题有利于减轻生活中含磷水污染，对人类的健康和对环境的文护都有极大的帮助。
2 使用的材料试剂、仪器设备和采取的方法、技术
2.1 使用的材料试剂、仪器设备
2.1.1 材料试剂
质粒：pTrcHis-C-inpN-gfp
菌株：E. coli JM109.
无机磷培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4• 7H2O 0.03 g，MnSO4• 4H2O 0.03 g，MgSO4• 7H2O 0.3 g，酵母膏0.4 g，蒸馏水溶解定容至1.0 L，pH 7.0-7.5。
2.1.2实验试剂
磷酸二氢钾贮备溶液：称取0.7165 g已于105 ºC干燥过的磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于100 mL去离子水中并定容至1.0 L。此溶液1.0 mL含0.5 mg PO43-。磷酸二氢钾标准溶液：含0.1 mg/mL PO43-；钼酸钠-硫酸溶液：1%(w/v)钼酸钠，10%(v/v) H2SO4。
2.1.3仪器设备
表2-1仪器设备图
仪器 型号 生产厂家
温度计 （0-100℃） 上海第三分析仪器厂
试管 1.5cm×15cm（×30） 上海市第三分析仪器厂
漏斗半径 4cm（×10） 上海市第三分析仪器厂
吸管 0.20ml（×2）、0.50ml（×4）、1.0ml（×3）、2.0ml（×4）、5.0（×4） 上海市第三分析仪器厂
恒温水浴锅 W201B 上海申胜生物科技有限公司
分光光度计 7220 上海申胜生物科技有限公司
注：分光光度计或者光电比色计（具有420nm左右的滤光片）。
2.2 质粒的提取
2.2.1准备工作
（1）检查buffer P1中是否已经加入RNase A。
（2）检查Wash Solution中是否已经加入了乙醇。
（3）检查buffer P2 和P3是否出现沉淀。
2.2.2质粒的提取
（1）取1.5-5ml过夜培养的菌液，8000×g离心2分钟收集菌体，弃尽培养基。
（2）在沉淀中加入250μL Buffer P1，彻底悬浮菌体。
（3）加入250ul Buffer P2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。
（4）加入350ul Buffer P3，立即温和颠倒离心5-10次混匀。
（5） 12000×g离心5-10分钟。将上清液移入吸附柱，8000×g离心30秒，倒掉收集管中的液体。
（6）加入500μL Wash Solution，9000×g离心30秒，倒掉收集管中的液体。
（7）重复步骤7一次。
（8）空气吸附柱于9000×g离心1分钟。
（9）将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50-100μL Elution Buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。
2.3 PCR扩增phoS（反应体系在冰上操作）
表2-2 PCR扩增体系
试剂名 反应组 对照组
10×PCR buffer 2.5μL 2.5μL
phoS1 1.0μL 1.0μL
phoS2 1.0μL 1.0μL
Mg2+ 1.5μL 1.5μL
dNTP 1.0μL 1.0μL
Taq 0.5μL 0.5μL
去离子水 17.5μL 17.5μL
E. coli JM109单菌落 加 不加
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