2。5。5  氮源浓度优化 8

2。5。6  pH优化 8

2。5。7  时间优化 8

3  结果与分析 8

3。1  对硝基苯酚（pNP）溶液标准曲线的制备 8

3。2  单因素实验结果分析 10

3。2。1  接种量大小对酶活力的影响 10

3。2。2  碳源种类对酶活力的影响 11

3。2。3  碳源浓度高低对酶活力的影响 12

3。2。4  氮源种类对酶活力的影响 12

3。2。5  氮源浓度对酶活力的影响 13

3。2。6  初始pH对酶活力的影响 14

3。2。7  发酵时间对酶活力的影响 14

结论 16

参考文献 17

致谢 19

1  前言

1。1  β-葡萄糖苷酶概述

β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。属于纤维素酶类[1]，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，其能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，释放出β-D-葡萄糖及相应配基[2]。微生物产β-葡萄糖苷酶的酶活性在不同的发酵条件下大小不一，一般来说β-葡萄糖苷酶在偏酸性条件下活性较高，其水解纤维二糖的能力较强，因其具有高度的耐热稳定性及高活性而对纤维质糖化工业极为有利，且与萜烯类香气前驱体有紧密联系，日趋受到人们的重视[3]。

1。2  重组马克斯克鲁维酵母概述

马克斯克鲁维酵母是目前研究较为广泛的一种非传统酵母，其具有耐高温、低耗能、生长周期短、染菌率低、底物谱广等特点[4]，越来越多地应用于工业生物技术领域。         

马克斯克鲁维酵母可以分泌菊粉酶、β-半乳糖苷酶等多种应用广泛的水解酶类[5]，相较于传统酵母，马克斯克鲁维高温酵母具有耐高温、底物利用宽泛、发酵性能高、分泌能力强、适于分子生物学操作等优势。

马克斯克鲁维酵母产β-葡萄糖苷酶的能力较弱，经重组后的马克斯克鲁维酵母产β-葡萄糖苷酶的能力大大增加，但与其他酶如葡聚糖酶等相比，其产量仍相对较低[6]。利用重组马克斯克鲁维酵母产β-葡萄糖苷酶纺织、酿造、造纸、食品、饲料、农产品加工、石油开采、医药、资源再生等方面均有重要应用[7]。但其较低的产量会使生产中的成本大大增加，因此探究其最优发酵条件以增大β-葡萄糖苷酶的酶活性来得到低廉的生产成本的问题迫在眉睫。就目前而言纤维素资源是个大量而且优质的能源，然而大量的纤维素能源如秸秆等，我们所见的大多都是放在稻田里焚烧，不仅污染了空气，还浪费了大量可利用能源，而本实验的研究恰恰可以解决这些问题，开发新能源，促进可持续发展。

1。3  课题目的

β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中起关键作用，但正常条件下，马克斯克鲁维酵母产β-葡萄糖苷酶的产量及酶活均较低，对底物无法进行有效分解，可能造成大量资源浪费与环境污染，重组马克斯克鲁维酵母解决了这一问题，本实验致力于提高其对纤维素等底物的分解效率，减少环境污染，开发利用新能源。纤维素酶类的工业化生产目前发展较快，已取得较高的经济效益。纤维素酶类的工业化生产一般分为固体发酵和液体深层发酵[8]，而因固体发酵容易染菌，所以工业化生产一般采用液体深层发酵，其特点还有易于控制，生产效率高等，而马克斯克鲁维酵母作为一种广泛的安全食用真菌，生长周期短，产酶较快，相较于细菌，具有更高的安全性，也不易受到污染，成本低廉，产品易得，用其生产酶制剂安全、可靠、不易产生毒素[9]，制得的酶更纯净。培养条件优化是提高酶活、增加微物产酶量的重要方法之一。本实验优化发酵条件采用单因素法进行试验，通过一步一步确定其各类最优发酵条件，来最终确定其最优发酵条件组成。