2  实验材料与方法

2。1  菌种

重组马克斯克鲁维酵母，淮阴师范学院实验室保藏

2。2  培养基

2。2。1  种子培养基

液体YPD培养基：葡萄糖2。0%（w/v），蛋白胨2。0%（w/v），酵母粉1。0%（w/v），蒸馏水定容至50 ml，121℃高温灭菌20 min。

2。2。2  发酵产酶培养基

初始培养基：0。2%YNB，1%葡萄糖，5 mmol/L乙酰胺（分子量59 g/mol）,用0。1M磷酸缓冲液（pH6。0）配制，121℃高温灭菌20 min。250 ml锥形瓶装液量50 ml（乙酰胺需过滤除菌）

0。1M磷酸缓冲液（pH6。0）：1 L蒸馏水中加入13。682 g二水磷酸二氢钠和4。405 g十二水磷酸氢二钠

乙酰胺：1。在100 ml的0。1M磷酸缓冲液（pH6。0）中加入1。475 g乙酰胺。

        2。装有乙酰胺的瓶子121℃高温灭菌20 min。

        3。在无菌环境中用针管吸取配好的溶液，装上200 μl过滤芯将溶液过滤到灭菌后的瓶子中，进行过滤除菌

0。2%YNB：锥形瓶中加入0。1 g YNB粉末和24 ml磷酸缓冲液（pH6。0）

1%葡萄糖：锥形瓶中加入0。5g葡萄糖和25ml磷酸缓冲液（pH6。0）

将0。2%YNB和1%葡萄糖放入灭菌锅121℃高温灭菌20 min。

在超净工作台上将0。2% YNB倒入1%葡萄糖，加1 ml乙酰胺，混匀。

2。3  主要仪器和试剂

2。3。1  仪器

苏州净化SW-CJ-2D型双人单面净化工作台，EPED-E2-10TF型实验室级超纯水器，DHG-9420B型电热恒温鼓风干燥箱，HYG-C型多功能摇床，TDL-5-A型低速大容量离心机，立式压力蒸汽灭菌器，MDF-U3386S型低温冰箱，PHS-3C型PH计，UV759紫外-可见分光光度计，HH-S型恒温水浴锅，FA2004B电子天平，250ml锥形瓶，试管，移液枪

2。3。2  试剂

柠檬酸缓冲液（50mM,pH4。8）：210 g一水合柠檬酸溶于750 ml蒸馏水再与蒸馏水按1:19比例稀释，NaOH调pH至4。8

pNPG溶液：0。1506 g pNPG溶于100 ml柠檬酸缓冲液（50mM,pH4。8）

对硝基苯酚溶液（10 mmol/L）:0。139 g pNP溶于10 ml蒸馏水，用时稀释10倍

碳酸钠溶液（1 mol/L）：20。12 g碳酸钠溶于蒸馏水定容至200 ml

2。4  实验方法

2。4。1  菌种扩大培养

在超净工作台上用移液枪吸取100 μl重组马克斯克鲁维酵母接入液体培养基YPD上，28℃，200 r/min摇床培养24 h，OD值0。6。

2。4。2  发酵产酶培养

在超净工作台上用移液枪吸取适量液体培养基YPD中的菌液到发酵培养基上，30℃，150 r/min摇床培养2至3天。

2。4。3  粗酶液制备论文网

取适量发酵液3000 r/min离心5 min，取上清液

2。4。4  酶活测定

2。4。4。1  酶活测定原理

采用比色法进行测定，以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷（pNPG）为底物，其水解释放出1 mol对硝基苯酚和1 mol葡萄糖，对硝基苯酚在400 nm可见光范围内有特征吸收峰[10]，可直接在400 nm下比色测定。

本方法的酶活性定义是：实验条件下1 ml酶液每分钟水解产生1 μmol的对硝基苯酚的酶活力，定义为一个酶活单位[11]。

2。4。4。2  酶活测定操作步骤

仪器：水浴锅温度调至70℃；紫外可见光分光光度计波长调至400 nm；离心机（3000 r/min，5 min）

试剂和材料：柠檬酸缓冲溶液（Ph4。8,50Mm）；pNPG溶液；对硝基苯酚溶液（10 mmol/L）；碳酸钠溶液（1 mol/L）。

实验步骤[12]：

①将待测发酵液离心取上清，稀释适当倍数待用。

②取试管若干做好标记：样品管、底物空白管和酶液空白管各一