2  实验材料与方法

2。1  菌种

重组马克斯克鲁维酵母,淮阴师范学院实验室保藏

2。2  培养基

2。2。1  种子培养基

液体YPD培养基:葡萄糖2。0%(w/v),蛋白胨2。0%(w/v),酵母粉1。0%(w/v),蒸馏水定容至50 ml,121℃高温灭菌20 min。

2。2。2  发酵产酶培养基

初始培养基:0。2%YNB,1%葡萄糖,5 mmol/L乙酰胺(分子量59 g/mol),用0。1M磷酸缓冲液(pH6。0)配制,121℃高温灭菌20 min。250 ml锥形瓶装液量50 ml(乙酰胺需过滤除菌)

0。1M磷酸缓冲液(pH6。0):1 L蒸馏水中加入13。682 g二水磷酸二氢钠和4。405 g十二水磷酸氢二钠

乙酰胺:1。在100 ml的0。1M磷酸缓冲液(pH6。0)中加入1。475 g乙酰胺。

        2。装有乙酰胺的瓶子121℃高温灭菌20 min。

        3。在无菌环境中用针管吸取配好的溶液,装上200 μl过滤芯将溶液过滤到灭菌后的瓶子中,进行过滤除菌

0。2%YNB:锥形瓶中加入0。1 g YNB粉末和24 ml磷酸缓冲液(pH6。0)

1%葡萄糖:锥形瓶中加入0。5g葡萄糖和25ml磷酸缓冲液(pH6。0)

将0。2%YNB和1%葡萄糖放入灭菌锅121℃高温灭菌20 min。

在超净工作台上将0。2% YNB倒入1%葡萄糖,加1 ml乙酰胺,混匀。

2。3  主要仪器和试剂

2。3。1  仪器

苏州净化SW-CJ-2D型双人单面净化工作台,EPED-E2-10TF型实验室级超纯水器,DHG-9420B型电热恒温鼓风干燥箱,HYG-C型多功能摇床,TDL-5-A型低速大容量离心机,立式压力蒸汽灭菌器,MDF-U3386S型低温冰箱,PHS-3C型PH计,UV759紫外-可见分光光度计,HH-S型恒温水浴锅,FA2004B电子天平,250ml锥形瓶,试管,移液枪

2。3。2  试剂

柠檬酸缓冲液(50mM,pH4。8):210 g一水合柠檬酸溶于750 ml蒸馏水再与蒸馏水按1:19比例稀释,NaOH调pH至4。8

pNPG溶液:0。1506 g pNPG溶于100 ml柠檬酸缓冲液(50mM,pH4。8)

对硝基苯酚溶液(10 mmol/L):0。139 g pNP溶于10 ml蒸馏水,用时稀释10倍

碳酸钠溶液(1 mol/L):20。12 g碳酸钠溶于蒸馏水定容至200 ml

2。4  实验方法

2。4。1  菌种扩大培养

在超净工作台上用移液枪吸取100 μl重组马克斯克鲁维酵母接入液体培养基YPD上,28℃,200 r/min摇床培养24 h,OD值0。6。

2。4。2  发酵产酶培养

在超净工作台上用移液枪吸取适量液体培养基YPD中的菌液到发酵培养基上,30℃,150 r/min摇床培养2至3天。

2。4。3  粗酶液制备论文网

取适量发酵液3000 r/min离心5 min,取上清液

2。4。4  酶活测定

2。4。4。1  酶活测定原理

采用比色法进行测定,以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物,其水解释放出1 mol对硝基苯酚和1 mol葡萄糖,对硝基苯酚在400 nm可见光范围内有特征吸收峰[10],可直接在400 nm下比色测定。

本方法的酶活性定义是:实验条件下1 ml酶液每分钟水解产生1 μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位[11]。

2。4。4。2  酶活测定操作步骤

仪器:水浴锅温度调至70℃;紫外可见光分光光度计波长调至400 nm;离心机(3000 r/min,5 min)

试剂和材料:柠檬酸缓冲溶液(Ph4。8,50Mm);pNPG溶液;对硝基苯酚溶液(10 mmol/L);碳酸钠溶液(1 mol/L)。

实验步骤[12]:

①将待测发酵液离心取上清,稀释适当倍数待用。

②取试管若干做好标记:样品管、底物空白管和酶液空白管各一

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