3。1。2生菜潮霉素筛选压的确定 16

3。1。3预培养的时间对农杆菌侵染的影响 16

3。1。4潮霉素抗性生菜植株的获得 17

3。2  T0代转基因植株的分子鉴定 18

3。2。1  T0代转基因植株的分子鉴定 18

3。2。1  T0代基因编辑植株的鉴定 19

4讨论与结论 21

4。1生菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 21

4。2受体系统的建立 21

4。2。1 激素的含量以及配比 21

4。2。2 抗生素的选压确定 22

4。2。3预培养的时间确定 22

致谢 23

参考论文 24

1绪论 

1。1 本论文的背景和意义 

1。1。1 生菜背景简介

     生菜（Lactuca sativa L。）是叶用莴苣的俗称,属菊科莴苣属,为一年生或二年生草本作物,是一种常见的叶食蔬菜。生菜最早是由古希腊人、罗马人将野生品种驯化而来的，后由地中海地区引种至我国。生菜多种于东南沿海，在很早之前就传入我国，具有悠久的历史，一般在城市的近郊区栽培的比较多，生菜在台湾地区种植的非常普遍。近些年来，食用生菜在老百姓的餐桌上变得非常普遍，饭店需求极大。随着社会的发展，生活节奏越来越快，各种西式快餐进入我国，而生菜正好是各种西方快餐的主要配菜。新鲜可口的生菜被采摘后，经过一系列程序加工成饭店可直接利用的材料，各种西式快餐店都对生菜有着非常大的消耗。论文网

    生菜中营养含量相当丰富,并且富含非常高的水分含量。通过检测生菜中水分含量占生菜全部的94%～ 96%,所以使得生菜的口感非常清脆爽口。生菜中的微量元素和膳食纤维同样非常丰富，含有镁、钾、钙、纳以及铁、铜、锌。研究显示，在每100 g生菜中含1～ 1。4 g蛋白质和部分碳水化合物[1] 。

生菜性质偏甘凉，因为在生菜的茎叶中含有莴苣素，所以味道微苦，具有清热提神、镇痛催眠、降低胆固醇、辅助治疗神经衰弱等功效[2]。生菜中含有甘露醇等有效成分，有利尿和促进血液循环、清肝利胆及养胃的功效[2]。

由于生菜有着广泛的用途和大量的需求，所以对于生菜的遗传改良和加快生菜育种过程的进程，必然成为当今社会绿色蔬菜最强烈地需求，所以在生菜转基因植物工程中，生菜遗传转化研究开展较早，有较好的遗传转化体系。关于生菜的遗传转化已有成功的报道[3]。

1。1。2 CRISPR/Cas9 基因组定向编辑技术及发展前景

     传统的转基因技术就是利用载体，将目的基因与基因组联系起来，但是这种转基因技术存在很大的缺陷，我们无法控制受体基因组的信息的随机破坏。而基因编辑法能够精确地定位基因组的位点，解决了转基因过程中很多无效的基因转载。CRISPR/Cas9系统的可操作，和高效性受到了更多科学家的青睐。CRISPR/Cas 系统是一种用来抵制外来物或噬菌体的后天免疫系统，最早发现于古生菌中和多数细菌中[4]。CRISPR/Cas9系统通过遗传转化在植物体内表达Cas9蛋白和gRNA从而对植物基因组进行编辑。另外一种是将在体外表达的Cas9蛋白和gRNA预先组装成核糖核蛋白复合体并导入受体细胞进行基因编辑, 然后将基因组被编辑的受体细胞诱导再生为完整的植株。CRISPR/Cas 的基因座结构简形(图 1)。以产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的典型TypeⅡ CRISPR/Cas 为例，其基因座结构可分别三部分，5' 端为 tracr RNA 基因，中间为一系列 Cas蛋 白 编 码 基 因 ， 包 括 Cas9、 Cas1、 Cas2 和Csn2，3' 端为 CRISPR 基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺序排列组成[5]。