CRISPR/Cas 的基因座结构简形

    CRISPR/Cas9系统作为一种新兴的基因编辑技术在拟南芥、水稻、小麦等植物的基因组编辑研究中取得巨大的发展, 但是在生菜中的应用还较少[6,7]。到目前为止，CRISPR/Cas9 技术已经非常成熟，并且在植物的遗传育种、性状改良、对逆境胁迫的响应等方面取得了一定的成果[8]。CRISPR-Cas9 系统表现出简便、高效、灵活的特性，并且又因为其成本低廉，在科学界有着不可磨灭的地位，所以CRISPR/Cas9 有着非常广阔的发展前景，基因组编辑技术是人类遗传 研究操作的又一个性技术[9]。与转基因技术相比，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术操作显现出更加简单与便捷的优点。

1。1。3 实验研究意义

     CRISPR/Cas9 基因编辑技术能够准确的对基因的特定位点进行碱基的缺失、修复以及插入等编辑，这项技术相对于锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应物核酸酶(TALENs)技术来说有着更加高效和易于操作的优点[10]。我们从三个方面来了解，CRISPR/Cas9 基因编辑技术是如何优越于ZFNs 和 TALENs 系统的。首先，CRISPR/Cas9 系统有着更强的可操作性。其次，CRISPR/Cas9系统可控性更高。第三，CRISPR/Cas9 系统的操作及其简单和方便，只需简单的几个步骤，以至于在任何的分子实验室都能够进行。就是上述的几个原因，使得CRISPR/Cas9 基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术。CRISPR/Cas9 系统也已成功应用到拟南芥(A。 thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum L。)和水稻(O。 sativa)等植物中。

1。2 CRISPR/Cas9 技术研究进展

1。3 本论文研究的主要内容和目的

    在生菜(Lactuca sativa L。)中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系。首先根据生菜FANCM基因序列设计靶位点, 构建Lsfancm-CRISPR/Cas9载体。然后以生菜子叶作为外植体, 通过农杆菌侵染、共培养、愈伤组织诱导、芽再生及生根培养等过程, 对生菜进行农杆菌介导的遗传转化, 共获得24株T0代转基因阳性植株。通过对靶位点序列进行PCR扩增、测序，并获得FANCM基因纯合突变体。

本研究首次通过传统的遗传转化方式, 即构建重组的CRISPR/Cas9植物表达载体、通过农杆菌介导的遗传转化, 在生菜体内表达CRISPR/Cas9系统进而对靶基因进行编辑。

1。4植物基因转化系统的建立及其主要影响因素

     植物基因能够成功的转化少不了一个优良的转化系统，只有优良的转化系统才能够将外源基因导入植株内并使得转化基因得到正常的表达。而外源基因导入受体细胞要借助媒介或者载体才能够成功和内源基因整合到一起，成功的将外源基因导入，并且将导入基因的性状表达出来，我们称为基因转化。植物基因转化系统分为三种类型,即种质转化系统、直接转化系统、载体转化系统[13]。其中载体转化体系中的农杆菌载体转化体系是现在研究最完善的体系。文献综述

1。4。1农杆菌侵染的敏感性检测

    遗传转化过程中抗生素的使用是为了抑制或杀死未转化的细胞或者组织, 恰当的抗生素浓度既能够将未转化的细胞充分的杀死, 又不影响转化细胞的正常生长。对于不同菌株对于抗生素的敏感性是不一样的，所以要在实验之前，进行转基因生菜潮霉素筛选压的确定。农杆菌载体转化是目前最成功的转化系统,其缺点是宿主的局限性,既使是同一植物,不同菌株的敏感性也不同。因此选择受体植物敏感的菌株是成功转化的重要因素之一。

1。4。2外植体的预培养

    外植体预培养具有促进细胞进行分裂的作用，在细胞分裂进行最旺盛的时期，是细胞与外源基因整合的最佳时期。并且通过预培养，可以及时发现外植体携带的污染物，此时可以对健康的外植体，进行筛选。